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别再用乙醇固定过夜了,教你20分钟快速完成细胞周期检测

2017-09-11 09:58:32  常州必达科生物科技有限公司  作者:SystemMaster  来源:

通过流式细胞术进行细胞周期检测主要基于碘化丙啶(PI)染色评估DNA含量的原理。 PI的结合特性确保DNA含量的准确定量,并且允许我们了解G1、S和G2细胞周期阶段或亚G1期凋亡细胞的分布。用PI进行DNA定量大多需要使用酒精或醛类固定,时间长,又费劲。此外,这些方法与荧光标?#24378;固?#21487;能会存在不兼容。 




为此,Yuqing Shen等人在2017年8月份的Bio Protoc. ?#21448;?#19978;发表了《Rapid Profiling Cell Cycle by Flow Cytometry Using Concurrent Staining of DNA and Mitotic Markers》优化了以前建立的低渗缓冲液破膜方法,使得PI可以和磷酸组蛋白H3(pH3)同时标记,既能在20分钟内完成染色,并且可以在传统三个周期的基础上,将G2期和M期区分开来。

材料
1、流式管
2、DPBS(Dulbecco’s phosphate buffered saline, no calcium, no magnesium )
3、Alexa Fluor® 647 rat anti-phospho-Histone H3 (pS28) (BD, BD Bioscience, catalog number: 558217)
4、柠檬酸钠(Sigma-Aldrich, catalog number: 1613859)
5、Triton™ X-100 (Sigma-Aldrich, catalog number: T8787)
6、Propidium iodide (PI) (C27H34I2N4) (Sigma-Aldrich, catalog number: P4170)
7、低渗裂解/ PI缓冲液,配方如下:
去离子水/蒸馏水、0.1%柠檬酸钠(重量体积比)、0.1%Triton X-100(体积比)、50ug/ml PI
注意:该缓冲液在4°C可保存数月。PI可能致癌,配制时需注意防护。

仪器
1、离心机
2、流式细胞仪

步骤
注意:所有的步骤均在室温下进行。
1、在流式管中,以1ml DPBS重悬0.4×10E6细胞。
2、200×g离心5分钟。
3、去掉DPBS。
4、以100ul低渗裂解/ PI缓冲液重悬细胞,并加入0.5ul Alexa Fluor® 647 rat anti-phospho-Histone H3,轻轻混匀。
注:由于低渗缓冲液可以去除大多数RNA,所以不需要加入RNase。
5、室温、避光孵育至少20分钟(但不要超过2小?#20445;?#19978;机检测,至少收集20000个有效信号。
注:上机前洗涤不会改变结果,反而容?#33258;?#25104;细胞丢失。

数据分析
如下图所示,排除掉碎片和粘连体之后,通过PI检测DNA含量可将细胞周期分为G1、S、G2/M三个期(C图),不过通过磷酸化组蛋白H3,进一步能将G2期和M期分开(D图)。
 


参考文献:
Bio Protoc. 2017 August 20; 7(16): . doi:10.21769/BioProtoc.2517.Aut

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